Pytanie:
Co decyduje o udanej ekspresji białka w E. coli?
Gergana Vandova
2011-12-17 01:54:43 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Niektóre białka dobrze wyrażają się w gospodarzu heterologicznym; inni - nie. Znanych jest kilka wymagań, które określają ekspresję białka, takich jak silny promotor (taki jak T7) do transkrypcji i silne miejsce wiązania rybosomu do translacji. Pracuję z białkiem, które składa się z 2 podjednostek - alfa i beta. Oba znajdują się na plazmidzie z promotorem T7 przed podjednostką beta (tj. Konstruktem jest promotor T7, CDS dla podjednostki beta, CDS dla podjednostki alfa). Podjednostka beta dobrze się wyraża, ale alfa nie. Czy uważasz, że ma to coś wspólnego z lokalnym środowiskiem (promotorami, RBS itp.) I jak bardzo to zależy od tego? Jak mogę zwiększyć ekspresję białka?

Niektóre aspekty nie są dla mnie całkowicie jasne. Dwie podjednostki są wyrażane na oddzielnych plazmidach lub? I wszystko w plazmidach jest takie samo, z wyjątkiem faktycznej sekwencji białka?
Dwie podjednostki znajdują się na tym samym plazmidzie. Sekwencja plazmidu zaczyna się od promotora T7, RBS1, podjednostki beta, RBS2, podjednostki alfa. Sekwencje RBS są trochę inne, więc myślałem o uczynieniu ich takimi samymi, ale nie powinno to mieć dużego wpływu na ekspresję białek. (są bardzo zbliżone do sekwencji konsensusu).
Cztery odpowiedzi:
#1
+9
Mad Scientist
2011-12-17 02:31:16 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Jednym z ważnych aspektów ekspresji białka z innego organizmu w E. coli jest to, że użycie kodonów w pierwotnym organizmie prawdopodobnie różni się od użycia kodonów E. coli użytych do ekspresji ( błąd dotyczący użycia kodonów).

Chociaż kod genetyczny jest zdegenerowany, nie wszystkie kodony są równe. Mogą kodować ten sam aminokwas, ale organizmy mają tendencję do faworyzowania określonych kodonów nad innymi, a tRNA dla tych kodonów zwykle występują w różnych stężeniach. Kiedy masz teraz dużo kodonów w swojej sekwencji, które są bardzo rzadkie w E. coli, ekspresja ucierpi, ponieważ tRNA dla tych kodonów nie jest obecne w wystarczająco wysokich stężeniach, aby utrzymać translację.

Tam Są dwa sposoby na to, aby to zrekompensować: albo sprawiasz, że E. coli produkuje więcej rzadkich tRNA, albo optymalizujesz swoją sekwencję, aby używać różnych kodonów. Jako pierwsze rozwiązanie możesz kupić pewne szczepy E. coli, które zawierają plazmidy kodujące tRNA rzadkie u E. coli, jednym z takich szczepów jest np. szczep Rosetta BL21.

Istnieje kilka firm oferujących syntezę zoptymalizowanych sekwencji w celu optymalizacji wykorzystania kodonów. Istnieją również narzędzia dostępne online, ale nie mam z nimi bezpośredniego doświadczenia.

Optymalizacja również nie jest tak łatwa, jak używanie za każdym razem najbardziej rozpowszechnionego kodonu, wykazano, że optymalizacja kodonów w celu dopasowania szybkość translacji w pierwotnym organizmie może zwiększyć wydajność ekspresji. W przypadku niektórych białek konieczne może być wstrzymanie miejsc podczas translacji, aby zapewnić prawidłowe fałdowanie. Jeśli białko nie złoży się prawidłowo, zostanie szybko zdegradowane, a plony ucierpią. Jest to opisane w artykule „Heterologous Protein Expression Is Enhanced by Harmonizing the Codon Usage Frequencies of the target Gene with the Expression Host” autorstwa Angov et al.

Ładne omówienie całego tematu znajdziesz w artykule „Jesteś jednym w googolu: optymalizacja genów pod kątem ekspresji białek” autorstwa Welsh et al.

Dzięki, szalony naukowcu! Tak, myślałem o optymalizacji kodonów i jest to zdecydowanie na mojej liście rzeczy do zrobienia. Przepraszam, że zapomniałem o tym wspomnieć. DNA 2.0 posiada oprogramowanie, które przekształci Twoją sekwencję w zoptymalizowaną. Słyszałem też o Rosetta BL21, ale nigdy z niej nie korzystałem. Możemy również chcieć trzymać się naszego własnego szczepu, ponieważ jest on heterologicznym producentem lub interesującym nas lekiem. Trochę martwię się optymalizacją kodonów, właśnie z powodu nieprawidłowego fałdowania, ale uważam, że powinniśmy to zrobić.
Ale to wciąż nie wyjaśnia, dlaczego druga podjednostka wyraża lepszą ekspresję, podobnie jak inne białka z tego samego natywnego organizmu są dobrze wyrażane w E. coli. Dlatego myślę, że jest to bardziej pytanie o elementy kontrolne transkrypcji i translacji niż rzadkie użycie kodonów.
@GerganaVandova Powinieneś porównać użycie kodonów w twoich dwóch podjednostkach, może być przypadkiem, że jedna używa więcej rzadkich kodonów niż druga.
Jestem na wykładzie Claesa Gustafssona z DNA2.0 - i myślę, że już to wiedzieliśmy - że użycie kodonów jest pomocne, ale nie zawsze działa. mają zastrzeżoną metodę, która jest bardziej niezawodna ...
#2
+6
Amy
2011-12-22 05:41:32 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Czy próbowałeś umieścić swoje dwa geny na dwóch oddzielnych plazmidach (oczywiście o różnych początkach replikacji i selekcji antybiotyków) i wyrażać w ten sposób? Jeśli pierwsza z dwóch podjednostek dobrze się wyraża, a druga nie, prawdopodobnie dlatego, że rybosomy odpadają z mRNA przed pełną transkrypcją drugiego genu. Czy geny są pochodzenia eukariotycznego? Myślę, że trudno jest „oszukać” rybosomy E. coli, aby traktowały heterologiczne sekwencje jako operon, ale może ktoś z większą wiedzą na temat translacji prokariotycznej mógłby pomóc.

Właściwie wystarczy dodać drugi promotor T7 na początku genu 2 prawdopodobnie by trochę pomogło:

Geny są transkrybowane z poszczególnych promotorów lub z jednego promotora, co prowadzi do długiego policistronowego mRNA. Donoszono, że ekspresja policistronowa prowadzi do niższej ekspresji bardziej kodowanego białka, które można wykorzystać do wpływania na stechiometrię kompleksu białkowego (9). Odnotowano kilkakrotnie wyższą ekspresję z poszczególnymi promotorami w porównaniu z transkrypcją policistronową (10). ( Źródło)

Wiem z własnego doświadczenia, że ​​koekspresja przy użyciu dwóch plazmidów może bardzo dobrze działać z odpowiednimi genami!

Dzięki za odpowiedź. Podoba mi się pomysł dodania dodatkowego promotora T7, chociaż powtarzające się sekwencje mogą prowadzić do innych przyszłych problemów (nie chcę wchodzić w szczegóły). Ale pracuję z genami, które są 3 razy większe i jeden promotor dla 2 podjednostek działa dobrze. Być może jest to bardzo specyficzne dla sekwencji.
#3
+2
Nick T
2011-12-17 11:19:41 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Mad Scientist omówił potencjalne problemy z odchyleniem kodonów (które można złagodzić za pomocą Rosettas), ale ogólnie widziałem ogromną zmienność szybkości ekspresji między różnymi wektorami (pET-28 vs pET-24) bez wyraźnego powodu. Nasze laboratorium odniosło ogromny sukces z wektorami indukowalnymi IPTG (przejście od pBC-SK do pET-24 zwiększyło ekspresję 50-krotnie).

Poza ekspresją białko może zostać utracone podczas przygotowywania ekstraktu bezkomórkowego. Może nie znajdować się w osadzie komórek, jeśli zostanie wyeksportowany dzięki uprzejmości peptydu sygnałowego, lub może zostać wyrzucony w osadzie „szczątków” podczas wirowania zlizowanych komórek, jeśli jest słabo rozpuszczalny. Słyszałem teorię, że problemy z rozpuszczalnością mogą być wyolbrzymione przez wektory, które nasycają maszynerię eksportową, co może zarówno utrudniać syntezę, jak i / lub być tak skuteczne, że po prostu powodują opady. Podręcznik systemu pET sugeruje, że dłuższy (przez noc) czas ekspresji w niższej (15-20 ° C) może pomóc w problemach z rozpuszczalnością. Bez względu na powód, inżynieria peptydu sygnałowego drastycznie zwiększyła ekspresję wielu naszych białek.

#4
+2
Gergana Vandova
2012-01-07 01:15:01 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Znalazłem bardzo fajną pracę: Designing Genes for Successful Protein Expression, która obejmuje większość czynników determinujących ekspresję białek. Wrzucam jego fragmenty, bo jestem pewien, że niektórym z Was się przyda.

Tłumaczenie można kontrolować na poziomie inicjacji i wydłużania. Inicjacja translacji zależy przede wszystkim od sekwencji miejsca wiązania rybosomu (RBS) i wczesnej struktury drugorzędowej mRNA. Inne determinanty ekspresji białek są gorzej poznane, ale równie silne.

1. Inicjacja translacji

Kluczowym składnikiem wpływającym na inicjację translacji u prokariotów jest RBS , który występuje między 5 a 15 zasadami przed otwartą ramką odczytu (ORF) AUG kodon startowy. Wiązanie rybosomu z sekwencją Shine – Dalgarno (SD) w RBS lokalizuje rybosom do kodonu inicjacyjnego ... Powinowactwo RBS do rybosomu jest krytycznym czynnikiem kontrolującym skuteczność, z jaką nowy inicjowane są łańcuchy polipeptydowe. Ta interakcja współzawodniczy z możliwymi interakcjami parami zasad obejmującymi region RBS, który może tworzyć się w samym mRNA. Zatem sekwencje SD ze słabszym parowaniem zasad do rybosomu są bardziej podatne na interferencję ze strukturą mRNA. Jednak niektóre eksperymenty sugerują, że sekwencje SD o zbyt silnym powinowactwie mogą być szkodliwe, szczególnie w niższych temperaturach, przez hamowanie początkowego wydłużenia. Również krytyczna jest odległość między RBS a kodonem start z 5-7 zasadami od konsensusu SD AGGAGG jest optymalny.

Liczne dowody sugerują, że początkowe 15–25 kodonów ORF zasługują na szczególną uwagę przy optymalizacji genów. Badania wykazały, że wpływ rzadkich kodonów na szybkość translacji jest szczególnie silny w tych pierwszych kodonach, w przypadku ekspresji zarówno u Escherichia coli, jak i Saccharomyces cerevisiae. U E. coli spadek peptydylo-tRNA podczas translacji początkowych kodonów wydaje się być zaakcentowany obecnością rzadkich kodonów NGG. Efekty te wydają się być niezależne od lokalnej drugorzędowej struktury mRNA. Prawdą jest również, że ekspresję można odzyskać przez zamianę sekwencji 5 'nawet dla sekwencji, które nie wykazują szczególnie silnej struktury mRNA lub zawierają rzadkie kodony lub inne oczywiste szkodliwe elementy w tym regionie.

2. Odchylenie kodonów

Drugim sposobem wykorzystania częstotliwości kodonów gospodarza jest dopasowanie częstotliwości kodonów hosta w zaprojektowanym genie. Można to zrobić po prostu wybierając każdy kodon z prawdopodobieństwem odpowiadającym częstości kodonów gospodarza ... Używając zestawów genów o szerokim zróżnicowaniu cech projektu genów, Welch i in. stwierdzili, że zmienność częstotliwości używania synonimicznych kodonów miała głęboki wpływ na ilość białka produkowanego w E. coli, niezależnie od lokalnych efektów sekwencji 5 '. Zaobserwowano zmianę co najmniej dwóch rzędów wielkości w ekspresji z powodu substytucji poza początkowymi 15 kodonami ORF. Ta zmienność była silnie skorelowana z globalną częstością użycia kodonów w genach, chociaż częstości kodonów stwierdzone w wariantach o najwyższej ekspresji nie odpowiadały tym występującym w genomie lub w endogennych genach E. coli o wysokiej ekspresji. Analiza wieloczynnikowa wykazała, że ​​częstości występowania określonych kodonów dla około sześciu aminokwasów mogą przewidywać obserwowane różnice w ekspresji. Nie jest jasne, jakie są biochemiczne podstawy tej korelacji.

3. Struktura mRNA i wydłużenie translacyjne

Chociaż wiele dowodów sugeruje, że struktura mRNA może zakłócać inicjację translacji zarówno u prokariotów, jak i eukariontów, wpływ struktury na wydłużenie jest mniej dobrze poznany. Może to częściowo wynikać z wewnętrznej aktywności helikazy rybosomów, która umożliwia translację nawet przez bardzo silne szpilki do włosów i może uniemożliwić wielu strukturom ograniczenie szybkości translacji u prokariontów lub eukariontów. Co być może ważniejsze, struktura mRNA jest trudna do przewidzenia, szczególnie w przypadku aktywnie tłumaczonych wiadomości, które są w ciągłym przepływie między różnymi stanami złożonymi i rozwiniętymi.

4. Specyficzne dla białka czynniki zapewniające dodatkową złożoność

Białko może być szczególnie niestabilne u żywiciela, zwłaszcza jeśli jest słabo sfałdowane z powodu naturalnej niestabilności, braku wystarczających czynników protetycznych lub nieprawidłowej potranslacyjnej modyfikacja ... Ekspresja białek wydzielniczych i błonowych może być ograniczona przez mechanizmy kierowania tych białek do błony. Jest nawet możliwe, że sekwencja aminokwasów białka może ograniczać wydajność translacji. Na przykład uważa się, że prolina ulega powolnej translacji w E. coli, niezależnie od używanego kodonu.

Ekspresja białka może być toksyczna dla komórki, prowadząc do niestabilności wektor ekspresyjny lub supresja gospodarza syntezy białek ... Powszechną strategią zmniejszania toksyczności jest obniżenie ekspresji do tolerowanych poziomów. Promotory o różnej sile mogą być cennymi narzędziami do znalezienia optymalnej szybkości ekspresji dla maksymalnej wydajności ... Jednym z potencjalnych sposobów uniknięcia toksyczności niektórych białek jest skierowanie ekspresji do peryplazmy lub pożywki. Można to osiągnąć przez fuzję N-końcową sekwencji sygnałowej wydzielania.

Aby uzyskać więcej informacji, przeczytaj cały artykuł. Polecam również przeczytanie Parametry projektowe do kontrolowania ekspresji genów syntetycznych u Escherichia coli.

Dziękuje ci za linki! Używałem DNA 2.0 do optymalizacji kodonów i syntezy genów już wcześniej i miałem dobre wyniki - jestem zdecydowanie zainteresowany lekturą ich publikacji.
@Amy: Tak, część artykułu dotyczy cech DNA2.0, które uważam za bardzo przydatne. Jestem nowym użytkownikiem i wciąż przyzwyczajam się do ich oprogramowania, ale na razie wygląda całkiem nieźle.


To pytanie i odpowiedź zostało automatycznie przetłumaczone z języka angielskiego.Oryginalna treść jest dostępna na stackexchange, za co dziękujemy za licencję cc by-sa 3.0, w ramach której jest rozpowszechniana.
Loading...