Pytanie:
Jak rozbija się skupiska komórek podczas pasażowania?
Rob O'Callahan
2011-12-22 07:55:37 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Pracuję z komórkami HepG2 i naprawdę lubią tworzyć skupiska. Pipetowanie w górę iw dół w TrypLE nie wydaje się być zbyt skuteczne w ich rozbijaniu.

Rob: czy Google może odpowiedzieć na to pytanie? Jeśli to możliwe, wróć i prześlij odpowiedź na swoje pytanie. Oto wskazówka: http://hepg2.com/index.html
Trzy odpowiedzi:
#1
+5
Jeremy
2012-01-17 09:40:10 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Stwierdzam, że dostaję grudki (z HeLa i podobnymi typami komórek) tylko wtedy, gdy zostawiam je w Tryple zbyt długo. Generalnie zostawiam je w temperaturze pokojowej (nie gorące) Tryple na ~ 8 minut, potem ustawiam naczynie pod kątem, zdejmuję pokrywkę, żeby zobaczyć "połysk" komórek na naczyniu (dzieje się to oczywiście w kapturze ). Następnie nadmuchuję połysk Tryple za pomocą pipety 1000ul, która usuwa przyleganie komórek. Są one na ogół znacznie mniej zbite, niż gdybym pozwolił Tryple usunąć przyleganie komórek.

#2
+3
kasia
2012-01-15 19:52:12 UTC
view on stackexchange narkive permalink

W niektórych protokołach tworzenia pierwotnych kultur (na przykład ze szpiku kostnego myszy lub endometrium szczura) istnieje etap, który wymaga przepchnięcia zawiesiny komórek przez dużą igłę, aby pozbyć się grudek. Oczywiście wiąże się to z wysokim ryzykiem uszkodzenia komórek, więc czasami zamiast tego używana jest kolagenaza.

Pomocne może być również przemycie komórek PBS bez jonów przed pasażowaniem i użycie tripyny z EDTA. Powinno to usunąć przynajmniej część wapnia z płytki, aby zahamować działanie białek adhezyjnych.

#3
+3
Valentinos
2012-02-17 21:28:23 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Zlepienia komórek, które nie dysocjują podczas rygorystycznego pipetowania, mogą być bardzo dobrze spowodowane wolnym DNA w zawiesinie komórek (np. jeśli trypsynizowano zbyt długo). Wolne DNA przyciąga komórki, które łączą się w całości tworząc grudki.

Dwa możliwe sposoby pozbycia się tych grudek:

  1. Odwirować zawiesinę komórek przy 5000 obr / min przez 2 minuty z przyspieszeniem na (na 4) i hamulec (na 3), pozwalając na wytrącenie cięższych cząsteczek. Następnie zassać ~ 0,5 ml zawiesiny z góry i przenieść do nowej kolby. W razie potrzeby powtórz.
  2. Używaj DNAse w stężeniach od 20-100 µg / ml (stężenie wynikające z użytku osobistego), o ile nie zamierzasz przeprowadzać eksperymentów związanych z DNA.

Zawsze możesz wrócić i kupić świeżą ampułkę z linii komórkowej, w której chcesz, aby grudki były wolne :)



To pytanie i odpowiedź zostało automatycznie przetłumaczone z języka angielskiego.Oryginalna treść jest dostępna na stackexchange, za co dziękujemy za licencję cc by-sa 3.0, w ramach której jest rozpowszechniana.
Loading...