Pytanie:
Czy istnieje optymalizacja odwrotnej transkrypcji dla długich, 9kb, transkrypcji?
Earl
2012-05-31 21:53:40 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Czy ktoś zoptymalizował RT dla długich transkryptów (9kb)? Dalszą aplikacją będzie amplifikacja PCR i przygotowanie biblioteki Illumina. Wykonanie zestawów starterów wewnętrznych do PCR, które są specyficzne, będzie rzeczą trywialną, o ile nie będzie sekwencji chimerycznych. Jeśli tak, prawdopodobnie zostaną zagruntowane. Jeśli ktoś wie o optymalizacji i / lub innych potencjalnych pułapkach, z przyjemnością je usłyszę.

Dwa odpowiedzi:
user560
2012-06-02 18:14:57 UTC
view on stackexchange narkive permalink

RT-PCR powinien dać ci ~ 10kb. Jeśli okaże się, że to nie działa, możesz komercyjnie skorzystać z zestawów RT-PCR dalekiego zasięgu (spójrz na przykład na Stratagene i Qiagen). Qiagen może obsłużyć do 12,5 kb w dwuetapowym systemie RT-PCR.

user137
2013-10-28 20:40:01 UTC
view on stackexchange narkive permalink

Przy dłuższych sekwencjach dNTP stają się ograniczające. Spróbuj dodać więcej dNTP, zachowując tę ​​samą ilość podkładu. Nie bój się przeprowadzić kilku reakcji przy różnych ilościach odczynnika, aby znaleźć optymalną ilość. Wydłuż także czas reakcji. Odwrotna transkryptaza i polimeraza DNA potrzebują więcej czasu, aby pokryć dłuższy transkrypt.



To pytanie i odpowiedź zostało automatycznie przetłumaczone z języka angielskiego.Oryginalna treść jest dostępna na stackexchange, za co dziękujemy za licencję cc by-sa 3.0, w ramach której jest rozpowszechniana.
Loading...