Spróbuję odpowiedzieć na tytułowe pytanie: skąd możemy poznać miejsca, w których wiążą się białka wiążące DNA? Wyjaśnię dwie eksperymentalne metody identyfikacji miejsc wiązania w DNA.

1. Ślad DNazy
2. ChIP-seq (receptura Ch romatin I mmuno- P z seq uencing)

Ślad DNaz

Możemy zlokalizować białka związane z DNA dzięki ich zdolności do ochrony DNA przed pewną degradacją. DNaza I rozszczepia DNA w prawie -losowy sposób i jest hamowana przez białka pokrywające („chroniące”) szkielet DNA.

Aby zlokalizować miejsce chronione przed DNazą Rozszczepiam, musimy pobrać trochę genomowego DNA i je potraktować. Do zbadania potrzebujemy oddzielnych, krótkich odcinków DNA - możemy je otrzymać z genomowego DNA przez amplifikację PCR na różnych odcinkach. Musimy oznaczyć te amplikony tylko na jednym końcu, promieniowanie beta jest dobrym wyborem etykiety.

Biorąc jeden wyznakowany amplikon, wystawiając go na działanie DNazy I przez krótki czas - nie wystarczająco długi do całkowitego strawienia - przecięty DNA o wszystkich możliwych długościach, który po rozdzieleniu za pomocą elektroforezy żelowej wygląda jak „drabina”. Czas trawienia musi być krótki, tak aby wiele DNA było przecinanych tylko raz, aby mieć pełną drabinę. Powtarzanie tego trawienia z obecnym interesującym białkiem daje drabinę z brakującym segmentem. Dzieje się tak, ponieważ Twoje białko chroni fragment DNA przed rozszczepieniem.

Ważne punkty: DNA jest oznakowane tylko na jednym końcu. Stąd widzimy tylko końcową część DNA po rozszczepieniu: jeśli DNA jest wyznakowane 5 'i przecięte na pół, widzimy tylko połówki 5'. Dzięki temu możemy oszacować położenie miejsca wiązania: jeśli nasze DNA ma 100 pz, a nasza drabina ma długość od 0 do 70 pz, to przerwa, to więcej od 85 do 100 pz, to nasze miejsce wiązania znajduje się gdzieś wewnątrz 70-85 pz od oznaczony koniec. Możemy zsekwencjonować fragment DNA i odczytać sekwencję nukleotydów 70-85.

ChIP-seq

Jest to niedawno opracowana metoda, która jest bardziej odpowiednia do badania miejsca, w którym białko wiąże się w całym genomie lub na całym chromosomie. Wymaga przeciwciała, które specyficznie wiąże twoje interesujące białko.

Po pierwsze, wykonuje się `` ujęcie '' globalnego wiązania białko-DNA przez naświetlanie komórek światłem UV, powodując kowalencyjne wiązania krzyżowe między DNA a wiązaniem białka. Chromatyna (DNA z towarzyszącymi białkami) jest izolowana z komórek i cięta na mniejsze fragmenty; wiązania krzyżowe chronią nasze „zdjęcia” białek i krótkie odcinki ich związanego DNA.

Ta mieszanina jest inkubowana z przeciwciałem (unieruchomionym na kulkach), które wiąże nasze białko będące przedmiotem zainteresowania. Możemy oddzielić kulki pokryte przeciwciałem, a tym samym nasze białko wraz z nim.

Wreszcie możemy sekwencjonować fragmenty DNA złapane w ten sposób. To jak „łowienie sekwencji wiążących”. Końcowym rezultatem jest rozkład miejsca, w którym nasze białko było związane w genomie w momencie zrobienia zdjęcia.

Idealnie fragmenty DNA powinny być wystarczająco długie, aby umieść je w unikalny sposób w genomie. Istnieją zaawansowane metody PCR i sekwencjonowania, które dzielą fragmenty DNA na „bąbelki” w emulsji zawierającej po jednej cząsteczce DNA. W ten sposób możemy sekwencjonować wszystkie obecne warianty, a licząc liczbę sekwencji („odczytów”) każdego typu, mamy miarę obfitości każdej sekwencji. Ta obfitość jest interpretowana jako zajęcie białka w różnych miejscach wiązania.

Badania wiązania DNA w całym genomie wykazały, że białka są rozmieszczone w genomie. Mają preferowane miejsca wiązania, ale mają również pewne powinowactwo do podobnych miejsc i spędzają część czasu związani z niefunkcjonalnymi bitami genomu.

Zwłaszcza u ssaków „prawdziwe” miejsce wiązania jest nie tylko (i nie zawsze) określane przez posiadanie sekwencji o najwyższym powinowactwie, ale także przez skupienie się z miejscami wiązania innych kofaktorów. Dzieje się tak, ponieważ u ssaków białka często wiążą DNA, nie pojedynczo, ale jako części dużych kompleksów, które mogą oddziaływać z nukleosomami i które umożliwiają regulację transkrypcji lub cokolwiek innego.

Moje pytanie brzmi: jak czy możemy dokładnie określić, z którymi miejscami się wiążą? Czy jest to sekwencja aminokwasów białka? A może jest to czynnik powtarzalności w przypadku, gdy wiążą się z wieloma lokalizacjami na chromosomie?

Możemy więc powiedzieć, w których sekwencjach (i gdzie w genomie, nawet przy jakim względnym zajętości) białka będzie wiązać się z DNA w wyniku eksperymentu. Możesz spróbować odgadnąć, gdzie wiążą się ze swoją strukturą, ale sposób, w jaki dokładnie to powiemy, jest eksperymentalny.

Sekwencja aminokwasów białka ostatecznie określa jego złożoną strukturę, a jest ich wiele Motywy wiążące DNA lub domeny, które pojawiają się w wielu różnych białkach. Niektóre motywy wiążą szkielet DNA niezależnie od sekwencji zasad, inne wiążą określone sekwencje.

Weźmy jako przykład palce cynkowe. Najbardziej znana klasa palców cynkowych w zasadzie wstawia alfa-helisę do głównego rowka podwójnej helisy DNA, gdzie pewne aminokwasy po odpowiedniej stronie alfa-helisy stykają się z zasadami nukleotydów. Te kontakty mogą być wiązaniami wodorowymi lub kontaktem van-der-Waalsa. (Np. Histydyna i seryna mają tendencję do tworzenia wiązań wodorowych guaniny; fenyloalanina „stosy pierścieni” między As i Ts; a treonina kontaktuje się z grupą metylową tyminy.)

Paluszki cynkowe często znajdują się w tablicach w białkach, jak można sugerować na podstawie „współczynnika powtarzalności”. Oznacza to, że pojedynczy palec może rozpoznać określoną sekwencję 3 lub 4 pz, która nie jest zbyt wyjątkowa. Białko zwykle ma 3 lub więcej palców trzymanych w regularnych odstępach, tak aby ten ciąg motywów: ZFa-ZFa-ZFb mógł rozpoznać sekwencję DNA: GCTAxxxGCTAxxxCCAA, która jest znacznie bardziej unikalnym miejscem (jest to wyimaginowane).

Więc tak, sekwencja białka i (a tym samym) struktura determinuje, jakie miejsca białko może wiązać (możesz sobie wyobrazić rozkład powinowactwa do sekwencji, będzie sekwencja `` szczytowa '') - ale znowu niektóre białka wiążą szkielet DNA nie- w szczególności, u ssaków często nie wiążą się same, ale w kompleksach.

Ludzie badali wiązanie białko-DNA, konstruując własne macierze palców cynkowych lub TALEN, a także konstruując własne Miejsca wiązania DNA, poprzez proces „sztucznej ewolucji”: wybieranie najsilniejszych wiązań, mutowanie ich i powtarzanie. Tego rodzaju badania mogą dać optymalny „kod wiążący”.